一、顯色淡，靈敏度偏低

　　1.試劑盒在運輸途中時(shí)間太長(cháng)，溫度太高；所以盡量縮短運輸時(shí)間，夏季應放冰塊降溫。

　　2.培養箱溫度不足37℃，應注意培養箱溫度，放入反應板后盡量減少開(kāi)啟次數以免影響溫度恒定，非隔水式培養箱尤其應注意。

　　3.試劑盒未充分平衡；所以試劑盒從2～8℃冰箱取出后打開(kāi)盒蓋，于室溫平衡至少20分鐘，確保所有試劑已平衡至室溫（約25℃）。

　　4.保溫時(shí)間不足；所以做實(shí)驗時(shí)一定注意時(shí)間的重要性，如果怕忘了時(shí)間，可以校正定時(shí)鐘準確定時(shí)。

　　5.洗滌時(shí)沖擊力太大、浸泡時(shí)間過(guò)長(cháng)、洗滌次數增加；按說(shuō)明書(shū)要求保留洗滌時(shí)間，準確記住洗滌次數。

　　6.移液器吸液量不足，吸嘴內壁掛水太多或內壁不清潔；所以保證校正移液器，吸嘴要配套，裝吸嘴時(shí)要緊密，吸嘴內壁要清潔，一次性使用。

　　7.蒸餾水水質(zhì)有問(wèn)題，要使用新鮮合格的蒸餾水。

　　二、假陽(yáng)性結果和假陰性結果

　　1、標本的采集與保存

　　  1)當標本采集保存不當產(chǎn)生溶血時(shí)，紅細胞中的血紅蛋白釋放到血清中，血紅蛋白具有過(guò)氧化物酶的性質(zhì)，其通過(guò)吸附或“PP效應”（蛋白質(zhì)間相互吸附的現象）結合后，可催化A、B液顯色而造成假陽(yáng)性

　　  2)反復凍融血清會(huì )使抗體效價(jià)跌落，所以測抗體的血清標本如需保存做多次檢測，宜少量分裝凍存。

　　  3)標本采集保存不當致細菌污染，菌體中可能含有內源性HRP，會(huì )產(chǎn)生假陽(yáng)性反應；標本在冰箱中保存時(shí)間過(guò)長(cháng)導致血清IgG聚合，易使間接法的試驗本底加深。因此，標本宜在新鮮時(shí)檢測。

　　2.加樣

　　  1)如果樣品稀釋液少加或血清多加，都會(huì )引起本底增高。對于間接法來(lái)說(shuō)，受上述兩個(gè)因素影響更大。因為血清中受檢的特異性IgG只占IgG中的一小部分。IgG的吸附性很強，非特異性IgG可直接吸附到固相載體上，有時(shí)也可吸附到包被抗原的表面。這些非特異性的IgG均可以和酶標二抗發(fā)生反應而造成較高陰性本底或假陽(yáng)性。如果加入的血清過(guò)多，高于規定的稀釋倍數，極易造成高值陰性。反之，造成假陰性。

　　  2)如果加入的酶結合物過(guò)多或加在較高的孔壁上或孔口，也會(huì )引起本底升高或假陽(yáng)性。

　　  3)如果血液未開(kāi)始凝固或凝固不*時(shí)就強行離心分離血清，此時(shí)的血清中仍留部分纖維蛋白原，在ELISA測定過(guò)程中可以形成肉眼可見(jiàn)的纖維蛋白塊，易造成假陽(yáng)性結果。

　　3.溫育

　  　1)由于ELISA試驗在一定溫度下的反應時(shí)間并不是反應的終點(diǎn)，溫育時(shí)間過(guò)短、溫度過(guò)低，易致顯色不全；溫育時(shí)間過(guò)長(cháng)、溫度過(guò)高，易致非特異性結合緊附于反應孔周?chē)y以清洗*，產(chǎn)生陰性高值或假陽(yáng)性反應。因此，要嚴格按規定的溫度和溫育時(shí)間進(jìn)行。

　　  2)由于水浴較難將溫度控制在穩定的范圍，因此我們每次試驗時(shí)應認真觀(guān)察水浴箱的溫度，盡量少開(kāi)啟水浴箱門(mén)，嚴格控制水浴的溫度為37±0.5。同時(shí)，微孔板不可重疊放置，以保證傳熱均勻，各板的溫度都能迅速達到平衡。

　　  3)由于試劑盒通常設定的反應溫度為37度，在這個(gè)溫度下溫育一定時(shí)間，蒸發(fā)的水分會(huì )很多，對于整個(gè)反應體系來(lái)講，各種反應物的濃度會(huì )不斷地增加，這樣必會(huì )導致反應*后的值升高。因此溫育時(shí)應貼上封板膠。

　　4.洗板

　　洗板在ELISA過(guò)程中雖不是一個(gè)反應步驟，但卻是決定試驗成敗的關(guān)鍵。ELISA就是靠洗板來(lái)達到分離游離的和結合的酶標記物的目的，通過(guò)洗板以清除殘留在板孔中沒(méi)能與固相抗原或抗體結合的物質(zhì)，以及在反應過(guò)程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗板時(shí)應把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來(lái)。在ELISA操作中，洗滌是*主要的關(guān)鍵技術(shù)，應嚴格按要求洗滌。洗板如不*，有酶結合物的非特異性吸附，將使空白值升高。另外，在間接法中如血清標本內的非特異性IgG吸附在固相上而未被洗凈，也將與酶標記抗體作用而產(chǎn)生干擾。

　　  1)各廠(chǎng)家的洗液是根據各自試劑的條件配制的，因此采用不配套的洗液常會(huì )得到不正常的反應結果，包括本底升高，所以不同廠(chǎng)家的洗液不應混用。

　　  2)洗液應按規定的倍數稀釋使用。試劑盒提供的洗液是濃縮的，過(guò)多稀釋洗液，會(huì )影響洗液的效果，而使反應的本底升高。反之造成假陰性。

　　  3)稀釋洗液的水應該是新鮮的蒸餾水，電導率小于1.5us/cm。如果水中含有過(guò)多的鈣、鎂離子，這些離子會(huì )占用表面活性劑，使試驗本底增高。

　　三、重復性較差，經(jīng)常有客戶(hù)反饋說(shuō)做了兩個(gè)復孔值相差太大。可能的問(wèn)題有：

　　  1.保溫時(shí)間不一致，洗滌條件不一致，操作人員不一致；重復測定標本，操作條件、人員等應盡可能與上次保持一致，以排除這些因素造成的不一致的可能性。

　　  2.樣品數量多少不一，加樣時(shí)間有長(cháng)有短；所以重復某一樣品時(shí)，加樣時(shí)間盡可能接近。

　　  3.加樣量不一致；樣品稀釋前應充分混勻，盡可能使用同一移液器并裝緊吸嘴。